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            組織培養常遇到的問題-組培

            文章作者:騰昊科技 發布時間:2022-01-22 20:56:08 瀏覽次數:3372


            1. 培養基配制注意事項

            植物組織培養最常用MS培養基,包含十幾種化合物。有些化合物相遇會發生化學反應產生沉淀,影響培養基的營養成分,所以MS培養基需要配制多種高倍母液。

             

            配制母液時,尤其涉及大量元素的母液時,一定要等一種成分溶解之后,再緩慢的添加另一種成分;切記一鍋煮,即不能將各種化合物一齊添加進去。

             

            2. 滅菌后培養基不凝膠或者凝膠偏軟

            植物凝膠、瓊脂都對酸性條件敏感,pH 值低于5很難成膠或凝膠偏軟,切記高壓滅菌前調節培養基 pH 值(5.5 - 6.0)。植物凝膠對二價陽離子濃度有要求,也就是相對于 MS 培養基,1 / 2 MS 培養基中植物凝膠要適當增加用量。


             

            另外滅菌后,倒出培養基前一定將培養基搖勻(帶防燙手套),因為瓊脂密度大底層含量高,容易造成培養基強度不均勻。

             

            3. 水解酪蛋白有酸水解和酶水解之分,在使用過程中有無區別?

            水解酪蛋白對胚狀體、不定芽的分化有良好的促進作用,通常用量在 500 mg/L,不管是酸解還是酶解,作用都是一樣的,酶解更有利于發揮其作用。

             

            4. 怎么溶解組培常用植物激素?

            IAA、IBA、GA、玉米素、多效唑等應先溶解于少量 95% 的乙醇中,再加水定容配制成母液。

             

            如有結晶析出,可考慮用 1 / 10 體積的乙醇溶解后再定容;2,4 -D 易溶于堿性水溶液,可用少量 1mol/L 的 NaOH 溶液溶解后再慢慢加水定容;KT 和 6 -BA 先用少量的 HCL 溶解,再加水定容到一定的濃度。

             

            5. 細胞分裂素使用濃度?

            一般情況下在培養基中加入 0.1~10.0 mg/L 的細胞分裂素(6 -BA/KT/ZT),多數用 1.0~2.0 mg/L,KT 濃度為 0.5~2 mg/L,濃度要根據實驗材料來調整。細胞分裂素可以單獨使用也可以與細胞生長素配合使用。


             


            6. 哪些植物激素能高壓滅菌,哪些不能高壓滅菌?

            IBA、NAA、6 -BA、2,4 -D 可高溫高壓滅菌。IAA、GA3、茉莉酸等不可高溫高壓滅菌,否則會分解失效,該類植物激素配制母液后需用 0.22 微孔濾膜過濾除菌,待培養基冷卻(50 - 60℃)后尚未凝膠前加入混勻。

             

            7. 培養基的 pH 值會凝膠硬度有無影響?

            有影響。

             

            若將培養基 pH 值調的過高(大于 6),則培養基偏硬,增加接種的阻力,會對外植體造成損傷。

             

            若將培養基 pH 值調的過低(小于 4.5),則培養基不能凝固,起不到固定外植體的作用。一般將培養基的 pH 調節至 5.5~6.0 為宜。

             

            8. 滅菌過程是否影響培養基的 pH 值?

            培養基中的蔗糖和激素在高溫滅菌過程中容易酸化,培養基 pH 值滅菌后會有所下降,滅菌前培養基的 pH 值偏低可能導致培養基不凝或偏軟。要求偏酸性的培養基可適當增加瓊脂或植物凝膠的用量。

             

            9. 應用 75% 的酒精進行種子消毒的過程中需要注意哪些問題?

            種子在消毒過程中使用 75% 的酒精應慎重,酒精滲透力極強,消毒時間過長會直接影響種子發芽率,所以建議消毒時間不應超過 1 min。

             

            10. 原始繁殖材料的消毒

            組培原始繁殖的外植體消毒,直接影響整個培養過程。

             

            從室外采回來的外植體需進行消毒,首先用自來水沖洗外植體,沖洗時間可根據采集部位不同而定,一般在 5~15 分鐘即可;在超凈臺中進行藥劑的處理,常用的藥劑處理有 70% 的乙醇溶液、9% 的次氯酸鈉溶液和 0.1~0.2% 的升汞溶液,具體可根據實驗材料而定。應注意的是經升汞滅菌的外植體必須用無菌水沖洗 6~8 次。


             


            11. 怎樣處理植物組織培養過程中出現的各種污染?

            植物組織培養過程中的污染來源主要分為 3 種:真菌、細菌、組織培養過程中的污染源

            在操作過程中,難免有菌落入培養基或植物材料上導致污染。不正確操作也會增加污染幾率。

            預防措施:通風、保持室內空氣干燥、紫外殺菌等。污染物品和污染培養基不要在培養室近距離開瓶洗刷。

             

            污染原因判斷:

            1)培養基污染 

            若污染菌類是零星分散在培養基中,可確定是人為引起的污染。比如:培養基滅菌不徹底,開瓶時間過長,滅菌后存放時間過長,高溫蒸汽滅菌器的溫度、壓力、時間沒有正確設,過濾滅菌過程中濾膜孔徑選擇,過濾滅菌器的滅菌處理,過濾滅菌操作等。這些均會影響培養基的滅菌效果。

            措施:嚴格按照實驗要求,滅菌規程操作。

             

            2)外植體污染 

            若污染菌類是從材料周圍長起,且發生在 5 天以后,則說明是材料帶的內生菌??赡苁墙臃N用具滅菌不徹底,接種時材料被污染;

            若從培養基以下開始長菌,發生時間較早,且有從里向外的趨勢,則說明是切口引起的污染,原因可能是未剪去兩個切口或者雖剪去切口但是所用器具帶菌;或者是未及時發現污染苗,接種過程中引起交叉污染;

            措施:取材時應仔細選擇,以減少污染的發生。

             

            3)操作環節污染 

            接種室是否清潔、干燥、密封,是否經常用紫外燈照射、甲醛熏蒸、70% 的酒精噴霧殺菌等;超凈工作臺擺放物品雜亂,長時間不換濾網,導致凈化能力降低;接種用具滅菌不徹底引起污染;操作不正確等。

            措施:每次接種前半個小時,用 20% 的新潔爾擦洗室內設備、工作臺面,再用紫外燈照射 20 min,噴灑 70% 的乙醇進行消毒。除了培養基、接種材料、器具和用具保證無菌外,同時在接種時還需要嚴格進行無菌操作。

            措施:

            1)真菌污染后,如果已形成孢子,則必須經高壓滅菌后扔掉;若是細菌污染,只要及時發現,將材料上部未感染菌的部分剪下轉接,材料仍可以用。

            2)用抗生素等殺菌藥劑處理。至今還未發現哪種抗生素能夠對各種菌都有效,并且常影響植物材料的正常生長分化。另一些藥劑,雖有的殺菌效果好,但往往容易引起鹽害,也無法利用。

             

            12. 外植體的選擇

            為了使接種后的誘導得以成功,選擇的外植體應該是幼嫩、處于生長旺盛時期的,選擇的外植體的體積不能過小,如若過小則會影響愈傷組織的形成,從而影響進一步的分化。因此,一般接種的外植體體積在 0.5~1.0 cm2 的范圍內即可。最適的為莖尖、帶芽、莖段,也可以利用葉子、子葉、根段、花器官組織等。

             

            13. 植物莖段組織培養需要注意哪些問題

            以莖段進行組織培養比較容易,一般取植物的嫩莖切段作為外植體,切成 0.5~1 cm 長的小段進行接種,保證每個莖段有一個芽點和一片葉子,將芽點部位以下垂直插入培養基凝膠中進行生根培養。

             


            14. 外植體接種需要注意的操作事項

            接種前首先進行滅菌消毒,接種所用的鑷子、解剖刀、剪刀等工具需要提前高溫高壓滅菌,提前 10 分鐘打開超凈工作臺,滅紫外 15~20 min,操作人員要用 75% 的酒精棉球擦手、工作臺和器皿,解剖刀和鑷子等隨時擦酒精灼燒,晾涼后備用。

            在無菌培養皿或濾紙上切割外植體,接種到培養基表面,注意瓶口傾斜接近酒精燈火焰。

             

            15. 組織培養中材料褐化現象

            不同品種以及生理狀態引起的褐化狀態不同。培養基過高濃度的無機鹽及高水平細胞分裂素會使褐化現象加重。培養條件不當,例如光照過強、溫度過高、培養時間過長等,均可使多酚氧化酶的活性提高,從而加重外植體的褐變程度。

             

            防治措施:

            選擇合適的外植體:選擇生長處于旺盛的外植體,可以使褐變現象明顯減輕。

            合適的培養條件:無機鹽成分、植物生長物質水平、適宜溫度、及時繼代培養均可以減輕材料的褐變現象。

            使用抗氧化劑:在培養基中,使用半胱氨酸、抗壞血酸、PVP 等抗氧化劑能夠較為有效地避免或減輕很多外植體的褐變現象。另外使用 0.1%~0.5% 的活性炭對防止褐變也有較為明顯的效果。

            連續轉移:對容易褐變的材料可間隔 12~24 小時的培養后,再轉移到新的培養基上,這樣經過連續處理 7~10 天后,褐變現象便會得到控制或大為減輕。

             

            16. 材料玻璃化問題

            植物材料不斷地進行離體繁殖時,有些培養物的嫩莖、葉片往往會呈半透明、水跡狀,這種現象通常稱為玻璃化。

             

            玻璃化為試管苗的生理失調癥,試管苗生長緩慢、玻璃化的嫩莖不宜誘導生根,繁殖系數有所下降。當培養基上細胞分裂素水平較高時,容易出現玻璃化現象。

             

            愈傷組織的玻璃化問題主要表現在培養過程中愈傷組織松散、脆易碎。葉子或是長出的愈傷一段時間后在其周圍出現水漬化,繼而影響整個培養基。

             

            防治措施

            在培養基中添加少量聚乙烯醇、脫落酸等物質,降低培養基中細胞分裂素含量及含氮化合物的用量,選用低 NH4 +水平的 B5 培養基,都能夠在一定程度上減輕玻璃化的現象發生;

            增加光照,對減輕試管苗玻璃化的現象有明顯的作用;在培養基中添加活性炭、馬鈴薯汁、間苯三酚等可有效的減輕和防止玻璃化。

             

            17. 材料水浸狀、變色、壞死、莖斷面附近干枯

            可能原因:表面殺菌劑過量,消毒時間過長,外植體選用不當(部位或時期)。

            改進措施:調換其他殺菌劑或降低濃度,縮短消毒時間,試用其他部位,生長初期取材。

             

            18. 材料長期培養幾乎無反應

            可能原因:培養基不適合,生長素的選擇和用量不當,植物激素對生長發育和生理過程的調節作用,往往不是某一種植物激素的單獨效果;環境溫度不適宜。

             

            改進措施:

            更換培養基或調整培養基成分,尤其是調整鹽離子濃度;

            調整激素的種類與配比,增加生長素用量,例如使用人工合成的生長素類似物 2,4 -D 等可有效促進細胞分裂和伸長,新器官的分化和形成;

            調整培養溫度等環境條件。

             

            19. 愈傷組織生長過旺疏松

            可能原因:由于培養基中激素添加過量,培養室溫度偏高,礦物質等無機鹽含量不當等因素引起的。

             

            改進措施:根據不同的品種、不同組織、不同器官,應適當減少激素用量,適當降低培養溫度,調整無機鹽(尤其是銨鹽)含量,適當提高瓊脂用量增加培養基硬度,避免愈傷組織生長過旺和疏松現象發生。

             

            20. 愈傷組織生長緩慢太緊密

            可能原因:細胞分裂素和生長素的用量過多,糖濃度過高。

            改進措施:減少細胞分裂素用量,調整細胞分裂素與生長素比例,降低糖濃度。

             

            21. 愈傷組織分化率低,畸形,分化出的芽多為葉狀芽或叢芽,芽生長困難,不易成苗。培養時間長時,再次愈傷組織化

            可能原因:生長素用量偏高,溫度偏高。

            改進措施:減少生長素用量,可以通過分化培養時在培養基中添加 GA3(濃度在 0.5~2 mg/L 之間)解決,并適當降低愈傷組織的培養溫度。

             

            22. 叢生苗過于細弱,不適于生根或移栽

            可能原因:細胞分裂素濃度過高或赤霉素使用不當,產生過多的不定芽;溫度過高,光照短,光強不足;不及時的轉移和分切,生長空間小。

             

            改進措施:

            減少細胞分裂素用量,免用赤霉素;

            延長光照時間,增強光照;

            及時轉接;

            降低接種密度;

            更換透氣的封口膜等。

             

            23. 組織培養過程中出現黃化

            可能原因:培養基中 Fe 的含量不足,各種礦質營養不均衡;培養環境通氣不良,瓶內有害氣體積累(乙烯、氨氣、甲醛)等會引起植物材料黃化脫落;激素配比不當;糖用量不足或長時間不轉移;pH 值變化過大;培養溫度不適;光照不足等。

             

            改進措施:

            改善組培條件,在配制培養基過程中檢查儀器設備是否準確;

            降低組培苗的接種密度,及時轉接培養物;

            使用透氣的封口膜改善瓶內通氣狀況;

            適當調節 pH 值、激素配比和無機鹽濃度;

            控制培養室內溫度,適當增加光照。

             

            24. 植物組培培養基都有哪些?

            MS 培養基:1962 年穆拉辛格和斯庫格為煙草細胞培養而設計,其中硝酸鹽的濃度高,適合植物原生質體、細胞和組織培養。

             

            B5 培養基:1968 年甘伯爾格為大豆細胞培養而設計,銨的濃度低。適合木本植物的組織和細胞培養。

             

            富鹽平衡培養基:是目前使用最廣泛的一類,特點是:無機鹽濃度高,微量元素種類齊全,濃度高;元素間比例適當,離子平衡性好,具有較強的緩沖能力、穩定性好、營養豐富,一般培養時無需再加入有機成分。

             

            高硝態氮培養基:代表性培養基有 B5、N6、SH。特點是:硝酸鉀濃度高,氨態氮濃度低,含有較高濃度的硫胺素(VB1)。

             

            中鹽培養基:大多是在 MS 培養基基礎上進行改良設計。特點是:大量元素無機鹽為 MS 的一半,微量元素種類減少、含量增高。維生素種類比 MS 增多,例如增加了生物素、葉酸等。

             

            低鹽培養基:無機鹽、有機成分含量濃度低,多用作生根培養的培養基。

             


            25. 木本植物(油料植物)組織培養中遇到再生苗無法生根時怎么辦?

            一般常用的 1 / 2MS 或者 1 / 2WPM 基本能夠滿足。如果增殖用的都生產正常,到生根的時候出現落葉,只能通過排除法一樣樣分析。

             

            首先看是不是培養溫度太高,使用瓶蓋后透氣性差,導致乙烯積累。其次,可以適當添加少量分裂素,或者更換生長素,以及多種生長素混合使用。

             

            26. 培養基中添加糖類作為碳源物質,有何重要作用?

            碳源為植物細胞提供能量來源,蔗糖較葡萄糖能更好地調節培養基內的滲透壓。微生物生長所需的碳源最常用的是葡萄糖。采用蔗糖作為培養基的碳源,可一定程度上減少微生物的污染。

             

            生長素和蔗糖濃度決定愈傷組織中維管束的類型與數量。

             

            27. 用于植物原生質體制備的材料,以及常用的滲透壓調節劑

            用于植物原生質體的材料需要選取生長旺盛的細胞,幼嫩的組織。無菌試管苗的葉片、胚軸及子葉、花藥,以及愈傷組織(懸浮細胞)等。

             

            常用的調節原生質體滲透壓的穩定劑主要有甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等。滲透壓濃度一般為 0.3~0.8 mol/L。

             

            28. 組培苗移栽需要注意的問題

            在移栽前打開三角瓶的封口膜,煉苗 3~5d 后取出小苗,用流水洗凈根部的培養基,然后移栽到盛有滅過菌的蛭石營養缽中過度一下,但要注意不可直接向營養缽中澆營養液(容易長菌),用透明的塑料薄膜罩住小苗 3~5d 后移栽到土里。

             

            29. 光照強度多少 lux 是如何計算的

            光照強度 = 光通量/單位面積。Lux 的換算比較抽象,一般以燭光為計算單位,現在所用的以電源發光的光源,記作國際燭光,即 25 瓦特的電燈其光強度等于 25 國際燭光。1 標準燭光 = 10.76 Lux。

             

            30. LED 光源在植物組織培養中的選擇

            光是植物生長中最重要的環境因子之一,并不是所有的光都有助于植物的光合作用。LED 光源 460nm 左右的藍光和 660nm 左右的紅光是植物最需要的光波,對植物的生長發育起著關鍵性的作用。

             

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